#mNGS采样小知识#
欢迎阅读第18期的干货知识：溶血标本无法开展mNGS检测？
一、溶血的定义
溶血是指红细胞破裂、血红蛋白逸出的情况，称为红细胞溶解，简称溶血。通常表现为血清或血浆中游离血红蛋白浓度升高。
血清中游离血红蛋白的“正常”浓度通常在0.22~0.25g/L之间，而血浆中的“正常”血红蛋白浓度通常在0.10~0.13g/L之间。
溶血标本的实验室分类
分类
血清或血浆中游离血红蛋白
预测颜色
未发生溶血
≤0.05g/L
*色
略微溶血
≥0.05-0.3g/L
*色到略带粉红色
轻度溶血
≥0.3-0.6g/L
粉红色到淡红色
中度溶血
≥0.6-2.0g/L
淡红色
严重溶血
≥2.0g/L
红色到棕色
二、溶血的原因
溶血是临床实验室中标本不合格的最常见原因，占比约40~70%。
引发溶血的原因包括血管内溶血（体内溶血或溶血性贫血）和从样本采集到处理分析过程中发生的体外溶血（假性溶血）。因此溶血可分为体内溶血和体外溶血。
（一）体内溶血
体内溶血的原因众多，如固有红细胞膜缺陷、异常血红蛋白、红细胞酶缺陷、红细胞免疫破坏、药物的*性或免疫效应、机械损伤和脾功能亢进等。根据体内溶血的来源可分为遗传性溶血性贫血和获得性溶血性贫血。遗传性溶血性贫血
1.血红蛋白生成缺陷：
a.地中海贫血
b.镰状细胞病
2.红细胞膜生成缺陷：
a.遗传性球形红细胞增多症
b.遗传性椭圆形红细胞增多症
c.阵发性睡眠性血红蛋白尿
3.红细胞代谢缺陷
4.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症
5.丙酮酸激酶缺乏症
获得性溶血性贫血
1.免疫介导性原因：
a.肺炎支原体感染（冷凝集素病）
b.自身免疫性溶血性贫血
c.自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮和慢性淋巴细胞白血病）
2.脾功能亢进
3.烧伤
4.感染：
a.疟疾
b.巴贝斯虫病
c.梭状芽孢杆菌
5.血液循环过程中的机械损伤：
a.弥散性血管内凝血
b.溶血性尿*症综合征
c.血栓性血小板减少性紫癜
d.人工心脏瓣膜
e.HELLP（溶血、肝酶升高和血小板降低）综合征
6.输血反应
输注不同血型献血者的血液。
7.药物、*素和其他原因
■可能引起溶血的药物如下：1.药物诱发的免疫溶血性贫血：β-内酰胺酶抑制酶、头孢替坦、头孢曲松、福达拉滨、静注免疫球蛋白、甲基苯丙胺、非甾体类抗炎药、青霉素、哌拉西林。2.药物相关性血栓性微血管病性贫血：3,4亚甲基二甲氧基苯丙胺（摇头丸）、安非拉酮、化疗药、氯吡格雷（波立维）、可卡因、环孢菌素、布洛芬、干扰素、甲氟喹、甲硝唑、呋喃妥因、喹硫平（思乐康）、奎宁、辛伐他汀（佐克林）、他克莫司（普罗格）、甲氧嘧啶/磺胺甲恶唑。3.氧化性药物性贫血：蚕豆、戊基和硝酸丁酯、局部使用苯佐卡因、氨苯砜、硝基呋喃类、非那吡啶、伯喹类、利巴韦林、异烟肼、利福平、帕吉特、维生素K。通常发生体内溶血时，抽出的血液可能已为溶血状态。而体外溶血则与血液样本的收集、处理、运输、加工和储存过程中的各种因素有关。
（二）体外溶血
穿刺困难
由于有效循环血量减少，弹性差，静脉充盈不良，静脉塌陷，管腔变小，使血液流入负压管内缓慢，采血时间延长，部分血液凝固，细胞机械破坏，造成溶血。抽血器具不合格
1.因为试管质量不过关，真空采血管在制造过程中，试管内壁处理不好导致血细胞挂壁而造成血细胞破裂导致溶血。2.常用抽血器具为真空负压管，负压过大或过小，均会造成溶血。负压相对较大，血液流入管底速度过快过猛，造成红细胞相互撞击，导致红细胞破裂，标本溶血。采血过程中，由于负压不够、漏气或抗凝剂剂量不足，使抽回血缓慢，血液间断地被吸入负压管内并混有气泡，造成溶血。3.采血针头口径过小，易引起溶血。4.抗凝试管中抗凝剂偏少也可导致溶血。采血技术欠佳
1.静脉穿刺时，为增加血流而挤压穿刺部位。
2.静脉穿刺处的消*酒精液未干即开始采血，可发生溶血。
3.采血时定位或进针不准确，针尖在静脉中探来探去，造成血肿和血样溶血。
4.针头过细或抽血速度太快，负压太大，红细胞通过针尖时破坏而溶血。
5.采血过程中止血带使用时间过长（超过3分钟）或过紧，从而干扰血流速度和流向，破坏体液和血细胞间的平衡，造成局部血液浓缩或激活凝血系统，造成标本溶血。
6.止血带系在伤口、结痂、伤痕处均可造成标本溶血。
7.采血量不足，相对低渗抗凝。
8.抽出的血液注入试管时用力过猛、速度过快，或带针头将血液注入试管，红细胞受挤压破裂。
采血后的处理、转运和存储方式不当
1.抗凝时剧烈摇晃或剥离血凝块等人为造成溶血。
2.抗凝管抽入血液后放置过久，没有马上均匀摇动造成溶血。
3.用注射器强行转移血标本可能造成溶血。
4.在不适宜的条件下（转速、时间、温度）进行离心造成溶血。
5.血样本采集好后未及时送检，放置时间过长，造成溶血。
6.运输条件为冷冻运输亦会导致溶血，运送途中剧烈振荡致使红细胞撞击破裂而溶血。
7.全血样本的冷冻保存和解冻。
三、溶血对病原mNGS测序的影响
对于血液标本，mNGS是对血液中的血浆游离核酸（包括人源宿主核酸和微生物核酸）进行无偏向性测序。
红
细
胞
破
裂
溶血会导致人源核酸溢出到胞外，增加了血浆中人源序列占比，进而稀释了病原微生物核酸，可能导致假阴性。同时，溶血导致血浆中血红蛋白含量升高，而血红蛋白影响PCR扩增效率，影响引物的结合，降低酶的活性，可能会导致建库失败。
IngeniSeq?建议
研究表明，严重溶血和过量的宿主核酸背景可降低mNGS的灵敏度。因此，溶血+到++，会有假阴性情况与建库失败风险，但是对于样本难以获得的患者可以尝试实验；如溶血超过+++，建议重新送样。
四、如何避免标本溶血？
那么，mNGS标本采样送检过程应如何避免溶血呢？
1.要尽量避开患者治疗和服用特殊药物时采血。
2.严格把控抽血器具质量，选择合适的针尖直径，可采用EDTA抗凝管保存全血标本。
3.选择合适的穿刺部位，切忌穿过血肿部位采血，消*穿刺部位后待自然干燥后开始采血。
4.规范采血操作，选择合适静脉，要求扎压脉带后1min内采血，避免用力拍打或反复握拳等不良动作，见血即松压脉带，并一针见血，抽血速度要慢。
5.静脉穿刺困难的患者，采血时止血带不要结扎时间过长，操作时见负压管内有回血可放松止血带，同时有节奏地推压抽血部位的上方，使静脉暂时充盈，增加血流量，充分发挥负压作用，使血流加快，增加抽血速度，防止溶血。
6.热敷穿刺部位可使局部组织温度升高，改善血液循环，血管扩张充盈，提高采血成功率。
7.抽血时针筒内产生的气泡不要注入试管中，否则易引起溶血，穿刺时发现泡沫可稍微变换针头的角度位置。
8.如使用注射器采血，宜确保针头牢固地安装在注射器上，以防出现泡沫，使用注射器时还需避免过度用力抽拉针栓。
9.采样后应立即轻柔颠倒混匀含有抗凝剂的血液样本，使其充分混匀。
10.血液放置时间不宜过长，采集后应尽早在合适条件下离心，使血浆分离出来。
11.妥善保存标本，以防发生溶血（一般4℃冰箱不超过48h）。
12.运输温度在合适范围内（切忌冷冻），运输过程中避免过度震荡而发生溶血。
13.一旦发现溶血标本，主动与临床联系，结合临床首先排除体内溶血的可能，在条件允许的情况下，应重新采集标本，否则应在检验单上注明溶血程度，以提醒临床医生注意。
参考文献
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