溶血性贫血的实验室检测
溶血性贫血的实验室检测一、溶血性贫血的筛查检测（一）血浆游离血红蛋白测定1.参考值50mg/L（1～5mg/dl）2.临床意义（1）血管内溶血时血浆游离血红蛋白明显增高；（2）血管外溶血时血浆游离血红蛋白不增高；（3）自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻度增高。（二）血清结合珠蛋白测定1.参考值0.7～1.5g/L（70～mg/dl）2.临床意义（1）各种溶血时血清结合珠蛋白均有减低，血管内溶血时减低显著；（2）肝脏病、传染性单个核细胞增多症、先天性无血清结合珠蛋白血症等可减低或消失；（3）感染、创伤、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、糖皮质激素治疗等可有结合珠蛋白增高。（三）血浆高铁血红素清蛋白测定1.检测方法生化法、电泳法2.正常值阴性3.临床意义阳性表示为严重血管内溶血（四）含铁血*素尿试验（Rous试验）1.原理铁离子在酸化的亚铁氰化钾溶液中生成蓝色的亚铁氰化铁，即普鲁士蓝反应。2.正常值阴性3.临床意义（1）慢性血管内溶血可呈现阳性，并持续数周；（2）常见于阵发性睡眠性血红蛋白尿症，在溶血初期可阴性。（五）红细胞寿命测定1.原理用51Cr标记红细胞检测红细胞半衰期。2.正常值正常红细胞半衰期为25～32天。3.临床意义溶血性贫血时常小于15天，这是确定溶血性贫血的可靠方法。二、红细胞膜缺陷的检测（一）红细胞渗透脆性试验1.原理红细胞在低渗氯化钠溶液中细胞逐渐膨胀甚至破裂而溶血。2.参考值?开始溶血：0.42%～0.46%（4.2～4.6g/L）NaCl溶液?完全溶血：0.28%～0.34%（2.8～3.4g/L）NaCl溶液3.临床意义（1）脆性增高：遗传性球形细胞增多症、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、遗传性椭圆形细胞增多症等；（2）脆性减低：海洋性贫血、缺铁性贫血、某些肝硬化及阻塞性*疸等。（二）红细胞孵育渗透脆性试验1.原理红细胞孵育过程中，葡萄糖的消耗增加，贮备的ATP减少，导致红细胞膜对阳离子的主动传递受阻，钠离子在红细胞内集聚，细胞膨胀，渗透脆性增加。2.参考值未孵育：50%溶血为4.00～4.45g/LNaCl37℃孵育24h：50%溶血为4.65～5.9g/LNaCl3.临床意义（1）脆性增加：遗传性球形细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血等；（2）脆性减低：珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、镰形细胞贫血等。（三）自身溶血试验及纠正试验1.原理红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，不能提供足量ATP，以维持红细胞内的钠泵作用。病人红细胞无菌条件下在自身血浆中温育48小时，使ATP储备减少，钠泵作用减弱，导致溶血增强。在孵育过程中，分别加入葡萄糖和ATP作为纠正物，并以氯化钠溶液为对照，观察溶血是否能被纠正。2.参考值?正常人红细胞经孵育48小时后，仅轻微溶血、溶血度3.5%?加葡萄糖和加ATP孵育，溶血明显纠正，溶血度均1%3.临床意义（1）遗传性球形细胞增多症时，孵育后溶血明显增强，加入葡萄糖及ATP后均得到明显纠正。（2）Ⅰ型先天性非球形细胞性溶血性贫血（G6PD缺陷症）时自身溶血加重，加葡萄糖和ATP均可部分纠正。（3）Ⅱ型先天性非球形细胞性溶血性贫血（丙酮酸激酶缺陷症）自身溶血明显增强，加葡萄糖不能纠正，加ATP才能纠正。三、红细胞酶缺陷的检测（一）高铁血红蛋白还原试验1.原理在被检血液中加入亚硝酸钠使血红蛋白变成棕色的高铁血红蛋白，当血液中有足量还原型辅酶Ⅱ（NADPH）时，棕色的高铁血红蛋白又被还原成亚铁型的血红蛋白。2.参考值高铁血红蛋白还原率75%；高铁血红蛋白0.3～1.3g/L。3.临床意义减低：蚕豆病和伯氨喹型药物溶血性贫血病人由于G6PD缺陷，高铁血红蛋白还原率明显下降。（二）氰化物-抗坏血酸试验1.原理?抗坏血酸钠与HbO2反应产生H2O2，氰化钠能抑制过氧化氢酶使H2O2不被分解，于是H2O2与还原型谷胱甘肽（GSH）发生反应，产生氧化型谷胱甘肽（GSSG），NADPH使GSSG再还原为GSH。?如红细胞中催化NADPH形成的G6PD酶缺陷，则GSH产生减少，蓄积的H2O2会把亚铁型的HbO2氧化成棕色的高铁血红蛋白。2.参考值（1）正常人血液要在4小时以上才变成棕色；（2）纯合子G6PD缺陷的血液变成棕色，在2小时内即变色，杂合子者要3～4小时变色。（三）变性珠蛋白小体生成试验1.原理?G6PD缺陷可致红细胞内的还原型谷胱甘肽（GSSG）含量减少，高铁血红蛋白增高，最后形成变性珠蛋白小体（Heinzbodies）。?取G6PD缺陷者血液，然后加乙酰苯肼于被检血样及对照标本中，37℃温育2～4小时，推薄血片，用1%煌焦油蓝染色。计算含5个或更多珠蛋白小体的红细胞百分率。2.参考值30%3.临床意义G6PD缺陷病、不稳定Hb、HbH病等Heinzbodies常高于45%。（四）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定1.原理G6PD使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长nm处，可通过单位时间生成NADPH的量来测定G6PD活性。2.参考值正常人有甚强荧光3.临床意义（1）G6PD缺陷者荧光很弱或无荧光；（2）杂合子或某些G6PD变异体者则可能有轻到中度荧光。（五）丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定1.原理在ADP存在条件下，PK催化烯醇式磷酸丙酮酸变为丙酮酸，在NADH存在情况下，丙酮酸被LDH作用转变成乳酸，此时有自发荧光能力的NADH变为NAD，荧光消失。2.参考值PK活性正常，荧光在20分钟内消失。酶活性（15.1±4.99）U/gHb。3.临床意义（1）PK严重缺陷（纯合子）荧光60分钟不消失（2）杂合子者荧光25～60分钟消失四、珠蛋白生成异常的检测（一）血红蛋白电泳1.原理在一定的PH缓冲液中，缓冲液的PH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。2.参考值正常人的电泳图谱显示4条区带，最靠阳极端的为量多的HbA，其后为量少的HbA2，再后为两条量更少的红细胞内的非血红蛋白成分（NH1和NH2）。3.临床意义（1）HbA2增高是诊断β轻型地中海贫血的重要依据（2）HbA2减低缺铁性贫血及铁粒幼细胞贫血HbA2减低（二）胎儿血红蛋白酸洗脱试验1.原理HbF抗酸能力较HbA强。把经固定后的血涂片置酸性缓冲液中保湿一定时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色而呈鲜红色。2.临床意义（1）脐带血、新生儿、婴儿阳性，成人小于1%（2）地中海贫血病人轻型者（杂合子）仅少数红细胞呈阳性，重型者阳性红细胞明显增多（三）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验1.原理在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性被沉淀。测定其滤液中Hb含量，即HbF含量。2.参考值成人2%。新生儿55%～85%，1岁左右同成人。3.临床意义增高：β地中海贫血明显增高，重型者高达80%～90%。急性白血病、再生障碍性贫血、纯红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。（四）HbA2定量测定1.参考值1%～3.2%2.临床意义同血红蛋白电泳（五）限制性内切酶谱分析原理:从白细胞、胎儿的绒毛或羊水细胞提取高分子量DNA，用适当的限制性内切酶降解。经琼脂糖电泳分级，用Southern印迹法把DNA转移到硝酸纤维素膜上，再与同位素标记的基因探针杂交后放射自显影。根据病人DNA限制性内切酶图谱的变化或限制性内切酶降解DNA片段长度的多态性，来分析是否存在珠蛋白基因的突变、缺失等缺陷。五、自身免疫性溶血性贫血检测（一）抗球蛋白试验1.原理抗球蛋白抗体可与多个不完全抗体的Fc段相结合起链接或桥接作用，导致红细胞凝集可被观察到，称为抗球蛋白试验（Coombstest）阳性。?直接Coombs试验阳性说明红细胞表面已结合有不完全抗体。?间接Coombs试验阳性则说明病人血清中存在着不完全抗体。2.参考值直接、间接抗球蛋白均呈阴性反应。3.临床意义（1）阳性：新生儿溶血病、自身免疫性溶血性贫血、SLE、类风湿关节炎等。（2）温抗体与冷抗体：AIHA大多属于温抗体型（3）抗体亚型：AIHA大多为IgG型抗体（4）间接Coombs试验：主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病、母体血清中不完全抗体的检测。（二）冷凝集素试验1.原理冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身红细胞、“O”型红细胞或与病人同型红细胞发生凝集，当温度增高时，凝集现象又消失。2.参考值效价1∶40，反应最适温度为4℃。3.临床意义某些AIHA病人的冷凝集素效价很高，有的效价可达或更高。（三）冷热溶血试验1.原理阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）病人的血清中有特殊溶血素，在0～4℃时，溶血素与红细胞结合并吸附补体，但不溶血，当升温至30～37℃则发生溶血。2.参考值阴性3.临床意义（1）阳性见于PCH。（2）某些病*感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、传染性单个核细胞增多症也可有阳性反应。六、阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检测（一）蔗糖溶血试验1.原理蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与红细胞膜的结合，使PNH病人的红细胞膜上形成小孔，遂使蔗糖进入红细胞而导致溶血。2.参考值阴性3.临床意义（1）PNH常为阳性。（2）轻度阳性亦可见于部分巨幼细胞贫血，AA，AIHA和遗传性球形细胞增多症。（二）酸化溶血试验1.原理PNH病人的红细胞对补体敏感性增高，在酸化的血清中（pH6.6～6.8），经37℃孵育，会发生溶血。2.参考值阴性3.临床意义阳性主要见于PNH，某些AIHA发作严重时也可阳性。（三）蛇*因子溶血试验?蛇*因子是以眼镜蛇*中提取的一种分子量为蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，通过旁路途径激活补体系统，使PNH的红细胞溶血。?本试验为特异性PNH试验。
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